‫کلونینگ مولکولی و بیان اینترفرون لامبدا یک انسانی در لیشمانیای لیزارد ایرانی

Abstract

‫‫سابقه وهدف: اینترفرون‌ها دارای عملکردهای فراوانی همچون خواص ضد ویروسی، ضد تکثیری و تنظیم کننده ایمنی می‌باشند و به همین دلایل در بسیاری از بیماریها به عنوان دارو مورد استفاده قرار می‌گیرند. یکی از این اینترفرونهای جدید اینترفرون لامبدا یک می‌باشد که توان آن در درمان عفونت‌های هپاتیت C به صورت داروی همراه با اینترفرون آلفا در حال کارآزمایی بالینی می‌باشد. اینترفرون لامبدا 1 نوترکیب در سیستم‌های بیانی مختلفی تا کنون بیان گردیده و در این تحقیق هدف بررسی بیان و کارآیی این پروتئین در سیستم بیانی لیشمانیای لیزارد ایرانی می‌باشد که برای اولین بار انجام می‌گیرد. روش بررسی: سازه بیانی اینترفرون لامبدا 1 انسانی در وکتور pLEXSY ساخته شد و در سلولهای لیشمانیا به کمک الکتروپوریشن وارد گردید. سلولهای ترانس فکت شده واقعی بعد از غربالگری از لحاظ بیانی در سطح mRNA و پروتئین بررسی گردید. پروتئین خالص سازی شده از لحاظ فعالیت بیولوژیک ارزیابی شد. گلیکوزیلاسیون پروتئین بیان شده نیز با روش دگلیکوزیله کردن آنزیمی برررسی شد. یافته‌ها: صحت کاست بیانی پس از ساخته شدن از طریق تعیین توالی تایید شد. کاست بیانی به لیشمانیا انتقال یافته و بیان اینترلوکین 29 نوترکیب ثابت گردید. مقدار پروتئین بیانی 075/0 میلی گرم در لیتر سوسپانسیون کشت بود. کارآیی پروتئین بیانی در آزمون ضد ویروسی 20درصد پروتئین استاندارد بود. تغییر در حرکت الکتروفورتیک پروتئین بیانی بعد از تاثیر گلیکوزیداز بر گلیکوزیلاسیون آن دلالت داشت. بحث و نتیجه‌گیری: بهینه سازی پپتید نشانه احتمالا باعث ترشح بهتر پروتئین خواهد شد. تغییر در روش خالص سازی و برخی اسید آمینه های پروتئین شاید در بهبود مقدار پروتئین خالص سازی شده و فعالیت آن تاثیر بگذارد. با وجود مزایایی چون کشت ساده و تغییرات بعد از ترجمه‌ای شبیه به پستانداران، میزان بیان پروتئین در این سیستم پایین بود و به نظر می‌رسد که برای تولید پروتئین در مقادیر بالا مقرون به صرفه نباشد. واژگان کلیدی: اینترفرون لامبدا، اینترلوکین 29، نوترکیب، لیشمانیا Background and aim: Interferons with different functions such as antiviral, antiproliferative and immunomodulatory action are effective medications in some diseases. One of these new IFNs is IL-29 from IFN-λ family which has antiviral activity and its potency accompanying with IFN-α in treatment of HCV infection is being evaluated (clinical trial phase II). Recombinant IL-29 has been produced in multiple expression systems previously but at this study we cloned and expressed this protein in Iranian leishmania lizard (I.L.L) for first time. Materials and Methods: The IL-29 expression cassette was constructed in pLEXSY vector. The leishmania cells were transfected by electroporation. After selection of transfectants the protein expression was evaluated at RNA and protein levels. The purified protein bioactivity and glycosylation was evaluated. Results: Accuracy of expression cassette after construction was confirmed by sequencing. Expression cassette was successfully transfected to leishmania cells and expression of recombinant IL-29 was proved. The yield of expressed protein was 0.075 mg/L of suspension culture. Purified protein showed 20% activity in comparison with standard protein. Electrophoretic mobility shift after glycosidase treatment indicated that expressed protein may be glycosylated. Conclusion: Signal peptide optimization may improve the secretion of protein. Despite of easy handling and culture of this eukaryotic host and mammalian cell like posttranslational modifications in this expression host, the expression yield of this protein was very low and it seems to be not economic for large-scale production. Keywords: interferon-λ1, interleukin-29, recombinant, leishmania